Лазерная флуоресцентная диагностика в медицине, пищевой промышленности, экологии

Научная библиотека Комментарии к записи Лазерная флуоресцентная диагностика в медицине, пищевой промышленности, экологии отключены

М.Александров, А.Воробьев, Е.Пашков, М.Филатов, И.Мищенко, Г.Багранова // ЭЛЕКТРОНИКА: Наука, Технология, Бизнес 3/2003, с: 54-60

Исследование явления флуоресценции в биологических объектах микробной природы, индуцированного лазерным излучением, позволило разработать универсальный метод экспресс-диагностики состояния этих объектов. Методически, метрологически и аппаратно обоснованная лазерная флуоресцентная диагностика (ЛФД) удостоена в 2002 году Государственной премии РФ.
МЕТОДЫ И СРЕДСТВА ЛАЗЕРНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ
Сегодня для диагностики и индикации различных процессов микробной природы применяются традиционные микробиологические, иммунологические и биохимические методы исследования. Физические и физико-химические методы (хроматографические, масс-спектрометрические и др.) дороги, требуют дополнительных реагентов и используются в основном в качестве вспомогательных методов ограниченного применения.
Микробиологические методы, при том что они иногда довольно сложны и дороги, требуют, как правило, еще и длительного времени, что не всегда удовлетворяет требованиям клиницистов. В частности, идентификация анаэробных бактерий, составляющих до 40–70% микрофлоры гнойной раны, усложняется в значительной мере длительностью (до 7–10 дней) их культивирования. Кроме того, из всей совокупности бактерий в настоящее время удается идентифицировать не более 40–50%, остальные же виды бактерий – некультивируемые. Усугубляет положение и отсутствие (или практическое отсутствие) в терапевтических, хирургических, стоматологических, дерматологических и других клиниках методов и аппаратуры для адекватной патологическому процессу экспресс-диагностики. В связи с этим авторы обратились к созданию методов экспресс-диагностики процессов микробной природы, в частности гнойно-воспалительных заболеваний, пищевых биотехнологий и экологии, на основе явления флуоресценции. Этот подход представляется перспективным для индикации микроорганизмов, поскольку многие вещества, участвующие в метаболизме микробных клеток, обладают характерными спектрами поглощения и флуоресценции.
Спектральные исследования проводили на экспериментальном лазерном волоконном многоканальном спектроанализаторе (рис.1), который работает следующим образом (рис.2). Лазерный луч от источника излучения (гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм) по гибкому световоду подводится к исследуемому объекту. При взаимодействии лазерного излучения длиной волны 633 нм с биологической тканью возникает отраженное от ее поверхности излучение и индуцированная лазером флуоресценция в диапазоне от 633 до 1000 нм. Это вторичное излучение воспринимается приемными световодами, составляющими единый волоконно-оптический кабель с осветительным световодом, и поступает в полихроматор. После плоской дифракционной решетки со спектралным разрешением 3 нм диспергированный свет попадает на многоканальный фотодетектор из линейки 1024 диодов, область спектральной чувствительности которого 300–1100 нм. С помощью специального ПО компьютера полученные данные обрабатываются и отображаются на его мониторе в виде спектра. Процесс экспресс-диагностики занимает не более минуты и даже секунды.
При использовании спектроанализатора незначительные изменения параметров лазерного излучения, приемных устройств и отдельных узлов оптической системы заметно влияют на форму спектральных кривых флуоресценции, а следовательно, и на конечный диагностический результат. Поэтому особое внимание уделяется амплитудно-спектральной калибровке показаний прибора. Перед проведением каждой серии измерений необходимо тестировать все блоки системы и проводить ее юстировку при комнатной температуре и нормальной влажности. При этом минимальная мощность зондирующего излучения на торце световода составляет 3–5 мВт, максимальная – 20–30 мВт. Калибровка экспериментальной установки проводится следующим образом: перед началом измерений с целью избавления от собственных шумов спектрометра снимается спектр сигнала, отраженного от абсолютно черного тела, который затем вычитается из измеряемых значений для получения реального спектра флуоресценции.
Для получения достоверных данных об исследуемом объекте необходимо иметь четкое представление о его характеристиках поглощения, рассеяния, а также о вероятной концентрации в нем тех или иных флуоресцирующих веществ.
Основной, наиболее удобный и часто используемый диагностический критерий при исследованиях in vivo (в объекте, в организме), – интегральная спектральная интенсивность флуоресценции

При исследовании особенностей спектральных характеристик исследуемых объектов было обнаружено наличие двух характерных пиков: первый – на 664 нм, второй – на 693 нм (рис.3). Для дальнейшего анализа использовалось соотношение интенсивностей флуоресценции на этих двух длинах волн. С целью избавления от шумов, которые неизбежно присутствуют при измерениях спектров слабой интенсивности, использовались не просто амплитуды на этих длинах волн, а интегралы в окрестности 5 нм:

Для дальнейших исследований и оценки вклада в спектр этих двух составляющих дополнительно использовалось соотношение:
М = S1/S2 и мощность флуоресценции в относительных единицах – I,отн.ед.
Опыт показывает, что работа по изучению диагностических возможностей регистрации интенсивности флуоресценции биологических объектов, ввиду большого количества разнообразных параметров, может наиболее успешно проходить лишь при наличии специально созданной базы данных, структура и математическое обеспечение которой соответствовали бы определенным целям исследования. Поэтому наряду с алгоритмизацией процесса и статистического анализа данных была создана база данных и СУБД.

ПРИМЕНЕНИЕ ЛФД В МЕДИЦИНСКИХ БИОТЕХНОЛОГИЯХ
Определение закономерностей флуоресценции микроорганизмов в чистых и смешанных культурах явилось экспериментально-теоретическим обоснованием клинического применения метода ЛФД для выявления микробов и вызываемых ими процессов, экспресс-диагностики гнойно-воспалительных заболеваний различной этиологии и локализации, дисбиозов желудочно-кишечного тракта, кариеса, оценки гигиенического состояния зубов и полости рта.
В области клинической микробиологии разработана методика и программный продукт для регистрации собственной флуоресценции микрофлоры человека при возбуждении ее излучением He-Ne-лазера и регистрации спектра флуоресценции в красном-инфракрасном спектральном диапазоне. Впервые изучены спектры флуоресценции 52 представителей микрофлоры, которые показали, что интегральная интенсивность флуоресценции культур микробов линейно зависит от их концентрации в исследуемом биологическом объекте. Высокая чувствительность метода позволяет оценивать концентрации бактерий от 1016 до 10 на 1 мл исследуемого биологического субстрата.
Выявлено, что различные виды микроорганизмов различаются не только по интегральной мощности флуоресценции, но и по показателям М и I,отн.ед.. Все изученные спектры имеют характерные пики флуоресценции на длине волны 665 и 700 нм. Эффективность ЛФД иллюстрируют кривые флуоресценции возбудителей туберкулеза и сифилиса на рис.4.
Проведенные исследования обосновывают возможность применения метода ЛФД для экспресс-диагностики и оценки эффективности лечения и прогнозирования течения заболеваний микробной этиологии.
В области дерматологии результаты исследования микробной обсемененности флуоресцентным методом совпадают с аналогичными показателями микробиологического метода и применяются для оценки типов кожи, диагностики и прогнозирования дерматологических заболеваний и косметических процедур.
В области терапевтической стоматологии результаты, полученные в ходе проведения измерений методом ЛФД, в целом подтверждаются бактериологическим методом. При этом удовлетворительная гигиена, выявленная флуоресцентным методом, всегда подтверждалась общепринятыми стоматологическими индексами. В то же время, диагностика флуоресцентным методом удовлетворительного и неудовлетворительного гигиенического состояния тканей и объектов полости рта в большинстве случаев не совпадала с клиническими показателями и это подтвердило тот факт, что определение гигиенического состояния полости рта флуоресцентным методом, как более чувствительным, предпочтительнее.
Экспериментальные и клинические результаты флуоресцентной оценки твердых тканей зубов позволяют говорить о ряде положительных свойств ЛФД. Во-первых, метод обладает высокой чувствительностью, а лазерное излучение данной мощности не вызывает «возмущений» в исследуемом объекте. Во-вторых, он обеспечивает определение кариозных изменений на этапе молекулярных, а не цветовых изменений тканей зуба. Данный факт говорит, что ЛФД можно применять для диагностики кариозного процесса, определения тщательности обработки полости перед наложением пломбы непосредственно на рабочем месте, мониторинговой оценки качества пломбирования зубов.
Регистрация сигналов с помощью гибкого световода обеспечивает исследование любых, в том числе труднодоступных, участков зубных рядов и поверхности зуба у взрослых и детей. Высокая воспроизводимость результатов обследования (погрешность в пределах 2–5%) позволяет расценивать ЛФД как весьма объективный вид исследования твердых тканей зубов, кариеса, его осложнений (пульпит, периодонтит) и пародонтита, т.е. заболеваний, охватывающих свыше 90% населения РФ.
В гнойной хирургии. На основании экспериментальных исследований и клинических наблюдений отмечено, что in vivo увеличение концентрации микроорганизмов приводит к усилению мощности флуоресценции, а уменьшение – к снижению интегрального нормированного показателя флуоресценции, что и легло в основу клинического экспресс-метода оценки эффективности антимикробных препаратов. Разработанный методологический подход позволил предотвратить осложнения и сократить сроки лечения больных на 2–15 дней в зависимости от степени тяжести заболевания.
ЛФД проявила себя как многофункциональная клиническая методика, открывающая возможность проведения большого спектра диагностических исследований – от определения наличия и степени тяжести патологических процессов в биотканях и организме больного в целом до проведения глубоких мониторинговых диагностических исследований местного и общего статуса больных с патологией микробной природы. Концепция ЛФД гнойно-воспалительных заболеваний дает возможность впервые в мировой практике предложить экспресс-метод диагностики, прогнозирования и оценки эффективности лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями и другой патологии микробной природы. На рис.5 приведена блок-схема аппаратно-программного комплекса ЛФД гнойной инфекции, где на графике распределения флуоресценции в реальном времени рост ее интенсивности (I) свидетельствует об ухудшении патологического процесса и неадекватном лечении, а снижение (II) – о реабилитации и адекватном лечении.
В отличие от большинства существующих методов, у ЛФД широкий диапазон клинических применений, он не требует введения дополнительных медикаментов или препаратов, обеспечивает практически бесконтактный способ диагностики, не имеет противопоказаний, не вызывает аллергических реакций.
Возможность точной пространственной и временной дозировки и транспортировки энергии по световодам позволяет осуществлять ЛФД как экстра-, так и интракорпорально, инвазивно или неинвазивно с использованием традиционных эндоскопических, лапароскопических и видеосистем. Метод ЛФД может применяться совместно с традиционными методами диагностики и лечения широкого круга заболеваний.
Метрологическое сопровождение (калибровка, нормированные количественные показатели флуоресценции) терапевтических и хирургических вмешательств ЛФД-метода дает новые знания о механизмах болезни, особенностях ее течения, лечения и процесса реабилитации в целом.

ПРИМЕНЕНИЕ ЛФД В ПИЩЕВЫХ И ПРОМЫШЛЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ
Пищевые продукты, такие как молоко, творог, сметана, сыр, пиво, вино, – все это результат жизнедеятельности бактерий (аэробных и анаэробных). Изменение качественного и количественного состава микрофлоры этих продуктов приводит к изменению их органолептических характеристик: цвета, запаха, консистенции, вкуса. Поэтому актуальность проблемы оценки качества продукта на всех этапах его изготовления, хранения, реализации и применения не вызывает сомнений. Эта проблема является общегосударственной и во многом определяет здоровье населения. Благодаря методу ЛФД появилась возможность экспресс-диагностики (за секунды, минуты) бактериальной обсемененности продуктов. Данная диагностика основана на знании основных спектрально-энергетических параметров бактерий, вызывающих порчу продуктов или нарушение технологии их изготовления и реализации.
Пример одного из предлагаемых применений метода ЛФД в пищевой промышленности – контроль производства сыра. Для этих целей в технологическую схему его изготовления включена волоконно-оптическая система ЛФД (рис.6), которая по изменению спектрально-амплитудных характеристик флуоресценции позволяет судить о нарушении технологии и, главное, определять, в каком звене технологической цепочки эти нарушения происходят. На основании полученных объективных данных своевременно (в экспресс-режиме) проводится коррекция биотехнологии. Кроме того, методика позволяет определять критические сроки объектoв очистки технологической системы, что существенно удешевляет процесс изготовления продукции и сокращает простой оборудования.
Предварительная апробация метода и аппаратуры ЛФД для оценки качества пищевых продуктов (молока, молочнокислых продуктов, сыра, вина, пива) подтвердила его эффективность на всех этапах их изучения, хранения, реализации и применения.

ПРИМЕНЕНИЕ ЛФД В ЭКОЛОГИИ
Как известно, в наш век глобальных природных и техногенных катастроф, различных проявлений терроризма, социально-бытовой и экономической неустроенности экологическая безопасность населения приобретает важное значение. В связи с этим развитие экспресс-технологий оценки безопасности окружающей среды (водных ресурсов, сельскохозяйственных угодий, промышленных и природоохранных объектов) приобретает чрезвычайную актуальность.
На основе методов и аппаратуры ЛФД возможно создание мониторинговых стационарно-лабораторных аналитических аппаратно-программных комплексов для контроля качества очистки питьевых и промышленных водоисточников на всех этапах очистки, включая оценку состояния сточных вод, водозаборных систем и отстойников, систем фильтрации, биологической и физико-химической антибактериальной обработки, систем доставки воды к потребителю (рис.7). Для полевых условий легко формируется мобильный вариант ЛФД-комплекса из переносной установки ЛФД и портативного компьютера.
Высокая чувствительность ЛФД-метода, возможность получения количественных результатов практически в реальном времени на принципе обратной связи позволяют своевременно проводить адекватные охранозащитные мероприятия. Создание и внедрение автоматизированных лазерных аппаратно-программных комплексов (рис.8) для мониторинга окружающей среды на основе разрабатываемых баз данных для экологических объектов позволит повысить экологическую безопасность как отдельных регионов, так и государства в целом.
Принципы и средства лазерной флуоресцентной диагностики окружающей среды на основе экспресс-индикации ее бактериальной загрязненности могут использоваться и для токсикологической экспресс-оценки воздействия неблагоприятных внешних факторов на растительный и животный мир, включая среду обитания человека. В частности, авторы выявили, что флуоресценция хлорофиллсодержащих биологических объектов существенно зависит от экологического состояния среды их обитания. Регистрируя показатели флуоресценции с помощью представленных аппаратуры и диагностических алгоритмов, можно оценивать состояние окружающей среды, сроки созревания урожая зерновых и плодоовощных культур, качество урожая и плодородие земельных и водных ресурсов. Предварительные поисковые исследования свидетельствуют о перспективности использования методов ЛФД.

<

p style=»padding-left: 30px;»>Полное содержание статьи: http://www.electronics.ru/files/article_pdf/1/article_1198_653.pdf

Рекомендуем для Вас


© Интернет журнал "ЛАЗЕРНЫЙ МИР", 2019
Напишите нам:
laser.w@yandex.ru

Back to Top