Лазерный мир

К. Лефорт, Р. П. О’Конор, В. Бланке, Л. Маньо, Х. Кано, В. Томбелейн, Ф. Левек, В. Кудерк и Ф. Лепру // Журнал Фотоника, №1, 2020, стр: 88-94

Многоцветная многофотонная микроскопия впервые экспериментально продемонстрирована на спектральной полосе возбуждения 300 нм (полная ширина на высоте половины максимума) благодаря использованию наносекундного источника суперконтинуума (СК) в компактном и простом исполнении с низкой частотой повторения импульсов. Интерес к такой широкой спектральной полосе, никогда не демонстрировавшейся до сих пор, подчеркивается in vivo: получены изображения клеток глиомной опухоли, стабильно экспрессирующих eGFP, привитых на мозг мыши и ее сеть кровеносных сосудов, меченных Texas Red®. Эти два флуорофора имеют спектральную полосу, охватывающую все доступные 300 нм. Параллельно аналогичное качество изображения получают на образце мышечной ткани мыши in vitro при возбуждении этим наносекундным источником СК или классическим высокочастотным, фемтосекундным квазимонохроматическим лазером. Это открывает путь для (i) простой и очень полной биологической характеристики, никогда не выполнявшейся до настоящего времени с многофотонными процессами, (ii) множественных средств контрастирования в нелинейном изображении, допускаемые использованием многочисленных флуорофоров и (iii) других многофотонных процессов, таких как трехфотонные.

1. Вступление
Многофотонная микроскопия (MФM) – ​широко распространенный метод для получения изображений с высоким разрешением, трехмерных и глубоких изображений живых или иссеченных тканей, включающий нелинейные процессы [1], такие как двухфотонная флуоресценция (ДФФ) и генерация второй гармоники (ГВГ) [2]. Скорость излучения ДФФ определенного флуорофора зависит от параметров возбуждающего лазера [3–6]: длительности импульса t, частоты повторения f и средней мощности – и следует закону, связанному с импульсной пиковой мощностью.

На протяжении многих лет квазимонохроматические МГц, фемтосекундные лазеры в ближнем инфракрасном диапазоне (БИК) и в основном титан-­сапфировые (Ti : Sa) источники преимущественно используются для МФМ [7]. Эти источники имеют ряд преимуществ: высокую частоту повторения, низкую энергию импульсов, большую спектральную перестраиваемость и высокую среднюю мощность. Другие монохроматические источники также использовались незначительно, такие как наносекундные [8], пикосекундные [4] и субпикосекундные лазеры [9]. Различные длительности импульсов от 100 фс до 100 пс с постоянной частотой повторения позволяют получать аналогичные многофотонные взаимодействия [10–12] при условии достаточной средней мощности и соблюдения уравнения (1).

Помимо временного аспекта источника возбуждения, его спектральные свой­ства имеют свое значение в МФМ и могут привести к определению трех критериев: (i) спектральная перестраиваемость позволяет возбуждать большую панель экзогенных или эндогенных флуорофоров; (ii) широкий спектр имеет возможность отображать несколько флуорофоров одновременно (многоцветный МФМ), даже те, которые имеют очень далекие спектры двухфотонного поглощения (ДФП); (iii) сформированный спектр позволяет в лучшем случае адаптироваться к спектру ДФП флуорофора. Таким образом, сверхширокополосные источники, называемые источниками суперконтинуума (СК), нашли свое место в МФМ [13].

Такие источники обычно основаны на спектральном уширении фемтосекундных импульсов в фотонно-­кристаллическом волокне (ФКВ), связанном с предшествующим или последующим сложным и дорогостоящим этапом формирования импульсов [14]. Эти высокочастотные фемтосекундные источники, имеющие спектральную полосу в лучшем случае 200 нм, были использованы для селективной ДФФ‑визуализации специфических флуорофоров [15–17] и для многоцветных МФМ [18–21]. Сообщалось также о реализации источника СК на основе пикосекундного лазера с дополнительными оптическими усилителями для демонстрации биоимиджинга ДФФ [22]. Насколько нам известно, ни один лазерный источник, удовлетворительно отвечающий трем ранее установленным критериям, не был выявлен для МФМ.

В данной публикации мы впервые экспериментально демонстрируем способность низкоскоростного, простого и компактного наносекундного источника СК генерировать многоцветные многофотонные процессы. Это иллюстрируется изображениями биологических образцов, полученных с беспрецедентной полосой возбуждения 300 нм в БИК спектре. В первой части доказательство принципа этого нового метода показано на резецированном образце мышечной ткани мыши. Полученные изображения ДФФ и СК сравниваются с изображениями, полученными с помощью классического источника возбуждения Ti : Sa. Для понимания аналогичного качества изображения проводится дальнейшее исследование пиковых уровней мощности. Во второй части мы выделяем адаптированное и сопоставимое разрешение в микронном масштабе, чтобы наблюдать ожидаемую чередующуюся структуру мышцы. Наконец, с помощью наносекундного возбуждения СК нам удалось продемонстрировать в естественных условиях многоцветный МФМ путем визуализации опухолевых клеток, имплантированных в мозг мыши одновременно с сетью кровеносных сосудов. Простым способом спектр СК формируется и адаптируется к спектрам ДФП обоих используемых флуорофоров, покрывая всю полосу пропускания 300 нм СК с их максимумами, разделенными 150 Нм, что приводит к оптимизированному излучению ДФФ.

2. Условия эксперимента
Наносекундный СК лазер является результатом спектрального уширения в одномодовом ФКВ усиленного модулированного лазерного диода с центром в 1 550 нм (1 нс, 10 мкДж, 250 кГц). ФКВ имеет длину 1 м и легированный Ge кремнеземный сердечник с длиной волны нулевой дисперсии, близкой к 1 400 нм. Таким образом, он накачивается в режиме аномальной дисперсии, что приводит к генерации ка примерно от 600 нм до 2 400 нм.

Результирующая длительность импульса источника ка составляет 1 нс при общей средней мощности 1 Вт. Спектр фильтруется между 700 нм и 1 000 нм с помощью набора фильтров высоких и низких частот. В результате средняя мощность 120 МВт заводится в вертикальный многофотонный микроскоп (BX61WI, компания Olympus, Япония), состоящий из системы сканирования, водно-­иммерсионного объектива микроскопа (XLPLN25XWMP, компания Olympus, Япония), двух дихроичных зеркал и двух фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) в сочетании с полосовыми фильтрами (575–630 нм; 390–420 нм на ДФФ и ГВГ каналы соответственно). Зеркальное отражение позволяет переключаться между возбуждениями от источника СК к фемтосекундному лазеру Ti : Sa (Chameleon Ultra II, Coherent, США; 150 фс, 10 нм, 680–1080 нм, 80 МГц, 4 Вт). На рис. 1А показана экспериментальная установка.

Изображения могут быть получены из одного или другого источника без перемещения объектива микроскопа или образца. Боковое и осевое разрешения рассчитаны соответственно при 0,4 мкм и 1,3 мкм с учетом длины волны возбуждения 810 нм.

3. MФM с наносекундным источником СК
Образец вырезают из мышцы ноги мыши, имеющей волокнистую структуру [23]. Каждое из волокон состоит из дисков миозина и актина, наложенных попеременно и перпендикулярно оси волокна. Миозиновая организация представляет собой не центросимметрическую структуру, дающую начало ГВГ [24]. Присутствие альфа-­актинина, цитоскелетного белка, связывающего актин, маркируется здесь иммуногистохимией с помощью вторичного антитела, связанного с Alexa Fluor® 546. Следовательно, полученный образец идеально подходит для обоих средств контрастирования: ДФФ Alexa Fluor® 546, выявляющий присутствие альфа-­актинина одновременно с ГВГ из структуры миозина. Отрезок 4 мкм фиксируется на предметном стекле микроскопа. На рис. 1b показаны спектры интенсивности обоих лазерных источников, измеренные на выходе объектива микроскопа, а также спектры ДФП Alexa Fluor® 546, eGFP и Texas Red® [25–27]. Лазер Ti: SA сосредоточен на длине волны 810 нм, максимум поглощения Alexa Fluor® 546.

На рис. 2 показаны изображения мышечной ткани размером 500 × 500 мкм2, полученные при освещении СК и Ti : Sa в случае ДФФ, ГВГ и обоих в сочетании с одинаковой интенсивностью цвета (время задержки пикселя 100 мкс). Как и ожидалось, волокнистая структура выявляется ДФФ (актином) и ГВГ (миозином) независимо от источника возбуждения, что доказывает способность СК‑лазера давать удовлетворительные многофотонные изображения. Поверхность образца, которая визуализирована с СК источника (рис. 2а), выглядит крупнее, чем на кристалле Ti : SA лазера (рис. 2d), особенно в отношении ДФФ. Интересно, что изображение ДФФ при возбуждении СК менее чувствительно к случайной плоскостности поверхности образца, возникающей в результате операций иссечения, резки и фиксации. Это различие является результатом распространения фокуса в глубине из-за цветности объектива с 300 нм спектральной полосой пропускания SC. Более лучшее осевое разрешение логически получено с лазером Ti : Sa. С другой стороны, изображение ГВГ, полученное с помощью источника СК (рис. 2б), более контрастно, поскольку только 60 нм из диапазона СК (780–840 нм) соответствуют генерации сигнала SH, который обнаруживается между 390 нм и 420 нм.

Начиная с этого предварительного сравнения, оцениваются и сравниваются доступные пиковые мощности обоих источников возбуждения. ФКВ источника СК накачивается в режиме аномальной дисперсии, что приводит к уширению спектра в сторону более длинных длин волн за счет модуляционной неустойчивости, генерации солитонов и сдвига собственной частоты солитонов [28]. В области нормальной дисперсии спектральное уширение индуцируется четырехволновым смешением между солитонами и дисперсионными волнами [29], которые, кроме того, испытывают солитонные столкновения, кросс-­фазовую модуляцию и эффект комбинационного рассеяния. После распространения в ФКВ, с чередованием временного сжатия и растяжения, начальная наносекундная монохроматическая волна накачки преобразуется в широкополосную наносекундную СК, состоящую из некогерентных коротких импульсов, пиковая мощность которых может составлять от нескольких десятков ватт до нескольких киловатт [30].

Эффективность преобразования лазера накачки 1 550 нм (10 мкДж, 10 кВт, 2,5 Вт) в используемый БИК диапазон (700–1 000 нм) составляет 5%, что приводит к получению высокоструктурированного наносекундного импульса с суммарной энергией 500 нДж и пиковой мощностью 0,5 кВт (рассматриваемой в среднем по всем субимпульсам), соответствующей 125 МВт средней мощности при 250 кГц. Результирующая энергия, пиковая мощность и средняя мощность, подаваемые на цель, составляют соответственно 370 нДж, 370 Вт и 92 мВт против 70 пДж, 460 Вт и 5,5 мВт для фемтосекундного лазера Ti : Sa. Таким образом, средняя пиковая мощность источника СК всего в 1,24 раза ниже, чем у лазера Ti : Sa.

Экспериментальный результат, показанный на рис. 2, был в конечном счете ожидаемым, учитывая, что пиковая мощность является основным физическим параметром источника возбуждения, ответственного за генерацию многофотонных процессов. Кроме того, в течение всего эксперимента не наблюдалось никаких фоторазрушений, независимо от источника излучения лазера. Основываясь на этих наблюдениях, наносекундный источник SC вполне способен генерировать процессы ДФФ и ГВГ таким же образом, как и лазер Ti : Sa.

Полное содержание статьи: https://www.photonics.su/files/article_pdf/8/article_8118_235.pdf