Лазерный мир

Т.А. Казакова, С.М. Новиков, Г.Г. Левин*, Г.В. Максимов// Вестник Московского университета. Серия 16. Биология, 2014

С помощью лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) разработан подход для исследования состояния плазматической мембраны (ПМ) и примембранной области цитоплазмы (ПОЦ) нейрона (позвоночных и беспозвоночных животных). Обнаружены изменения состояния ПМ и ПОЦ нейронов в покое и при модификации функционального состояния нейрона (ацетилхолин). Разработана методика оценки кинетики изменений ПМ и ПОЦ в разных участках нейрона. Обнаружены регулярные процессы ПМ и ПОЦ, частота которых зависит от функционального состояния нейронов. Предположено, что флуктуации зависят от изменений рельефа ПМ, перестройки примембранного цитоскелета и движения внутриклеточных везикул в ПОЦ нейрона.

Специфика нервной клетки для исследования заключается в исключительной зависимости ее функционального состоянии и клеточной динамики от метода исследования. Как правило, для изучения состояния ПМ и ПОЦ используются методы флуоресцентной и ЭПР-спектроскопии, что сопряжено с введением в клетку молекулярных зондов, нарушающих структуру клеточной мембраны и изменяющих состояние цитоплазмы. В наших исследованиях использовался метод лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ), позволяющий исследовать состояния ПМ и ПОЦ нейрона без изменения структуры и нарушения механизмов функционирования.

Исследования оптических свойств мембраны и примембранной цитоплазмы при различном функциональном состоянии нейронов проводили методом ЛИМ [7, 8]. В экспериментах использовались специальные герметичные термостатируемые камеры, в которых осуществлялась перфузия раствора, без изменения положения объекта. В качестве источника излучения использовали He-Ne лазер (633 нм, 1,5 мВт.). Линейно-периодическая модуляция фазы опорной волны осуществлялась зеркалом с помощью пьезо-преобразователя (частота 1 кГц). Для регистрации интерференционного сигнала и его аналого-цифрового преобразования использовался координатночувстви-тельный фотоприемник-диссектор (устройство, состоящее из фотоэлектронного умножителя (ФЭУ), отклоняющих катушек и электронного блока). Величина фазовой высоты, соответствующая измеряемой оптической плотности (в нм), регистрировалась с чувствительностью 0,5 нм, периодичность выборки и скорость ввода изображения определялись частотой модуляции 1 Кгц (или 0,9 мс на пикс).

Принцип действия ЛИМ основан на измерении локальных фаз света, отраженного объектом [9]. Лазерный луч разделяется на два, один из которых, проходя через клетку, отражается от зеркальной подложки, на которой находится клетка (отраженный луч). Другой луч является контрольным и не проходит через объект, а отражается от зеркала пьезопреобра-зователя (опорный луч). Рассеянный объектом луч в плоскости фотоприемника интерферирует с опорным лучом и создает в фотоприемнике распределение фототоков, что формирует интерференционную картину (фазовое изображение объекта). При построении фазового изображения сигнал нормировался по длине волны, определялась величина оптической разности хода (ОРХ) двух лучей, иначе называемая фазовой высотой (Ф).

Итак, нами разработан подход для оценки состояния ПМ и ПОЦ нейронов позвоночных и беспозвоночных с применением метода лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ). Обнаружены изменения состояния ПМ и ПОЦ нейронов в покое и при модификации функционального состояния клетки с помощью нейромедиаторов (ацетилхо-лин). Разработана методика оценки интенсивности

этих изменений в разных участках нейрона и проведена оценка состояния ПМ и ПОЦ нейронов во времени. Обнаружены регулярные процессы ПМ и ПОЦ, частота которых зависит от функционального состояния нейрона. Вероятно, эти флуктуации обусловлены изменениями рельефа мембраны при перестройке примембранного цитоскелета и движении внутриклеточных везикул в примембранной области цитоплазмы нейрона.

Полное содержание статьи на https://cyberleninka.ru/article/n/issledovanie-sostoyaniya-tsitoplazmy-neyrona-metodom-dinamicheskoy-fazovoy-mikroskopii/viewer