Лазерный мир

 Оптический, или лазерный пинцет предназначен для захвата отдельных объектов, которые настолько малы, что сфокусированный луч света – единственное средство приложить к ним точно заданную по величине и направлению силу. Впрочем, те, кто работает с такими установками, предпочитают называть их оптическими ловушками. У лазерного пинцета нет двух «хватательных» поверхностей. Объект ловит и удерживает один луч. В упрощенном виде «матчасть» такова. Когда свет встречает на своем пути некое тело, их отношения развиваются по трем сценариям: поглощение, отражение или преломление. В последнем случае фотоны после встречи меняют траекторию, отклоняясь наружу от оптической оси (вспомните, как выглядит карандаш, до середины опущенный в воду), и одновременно передают часть импульса телу, подталкивая его в противоположную сторону. Если правильно сфокусировать луч на предмете, суммарное воздействие фотонов будет толкать его в центр луча и к точке фокуса, как бы запирая в трех измерениях. Именно это на практике осуществил Ашкин. Тогда же, в 1980-х принцип успешно попытались применить для манипуляции биологическими объектами. С тех пор технологию развивают. Например, в Петербургском политехническом университете (комплекс «Нанобиотехнологии»), где функционирует установка «Лазерный пинцет».

Основное помещение научно-исследовательского комплекса «НаноБио» похоже на биологическую лабораторию. На столах пробирки, перчатки. По соседству стоят инкубаторы, где развиваются какие-то сложные отношения между ДНК и ферментами. Нам же – по коридору и в подвал. В небольшой комнате – рабочее место с компьютером и нечто, напоминающее огромный стол, на котором «расставлены» микроскоп и целая куча устройств. Свет в ИК-спектре человеческим глазом не воспринимается, и хотя луч, прежде чем попасть в объектив микроскопа, проходит сложную траекторию над «столом» через зеркала и линзы, рассчитывать на «лазерное шоу» нечего.

В теории все самое интересное – на мониторе. Но я вижу только два темных  пятнышка на светлом фоне.

 

•  Механические свойства молекулы ДНК и ее взаимодействие с белками. «Если приложить достаточную силу, около 60 пиконьютонов, двойная спираль ДНК развертывается и превращается в две отдельные нити, — объясняет сут Георгий Побегалов. — При этом молекула удлиняется. Метод оптического пинцета позволил показать, что в это время там происходит раскручивание и образование локальных разрывов. Другой момент – взаимодействие ДНК с белком. Можно белок пометить флуорофором и увидеть, как он связывается с ДНК. Посмотреть, как из коротких молекул, мономеров, в точках нуклеации образуются белковые «нити» — филаменты.»
• Скелет» клетки. » Мы изучаем бактериальный цитоскелет методом субдифракционной микроскопии, — рассказывает аспирант Алексей Ведяйкин. — Один из белков цитоскелета – ftsZ. Бактерии, у которых он не синтезируется, удлиняются до нескольких десятков микрон вместо 2-4, но не могут разделиться. Причины две: первая – мутация, вторая – SOS-ответ. Когда у бактерии повреждена ДНК, высока вероятность, что при делении образуются две нежизнеспособные клетки. Процесс останавливается, пока ДНК ни будет отрепарирована. SOS-ответ во многом помогает бактериальным клеткам пережить воздействие антибиотиков.»
• Мембраны раковых клеток. Цитоскелет напрямую связан с мембраной клетки. От их свойств зависит, сможет ли клетка противостоять воздействию внешней среды. Аспирантка Наталья Морозова с помощью лазерного пинцета проверяет прочность мембраны раковых клеток печени человека: «У мембраны есть такие характеристики, как натяжение и вязкость. Они различаются у нормальных и раковых клеток. До сих пор эти параметры мерили не на клетках, а на выделенных фракциях их мембран. Мы же прикрепляем к конкретной клеточной мембране микросферу, а потом ее оттягиваем. Между шариком и клеткой образуется тонкая трубка  из мембраны. И мы можем измерить силу их взаимодействия при разных условиях.»
• Бактериальная «самооборона». » Некоторые бактерии обладают системой рестрикции-модификации – механизмом, позволяющим остановить атаку на колонию вируса-бактериофага. У бактерий, владеющих этой системой, с ДНК взаимодействуют два фермента, — объясняет Наталья Морозова. — Метилаза добавляет в определенных местах ДНК метильную группу (CH3). А рестриктаза режет ДНК в тех же местах, если метильной группы там нет. Это своего рода «охранная грамота». Когда клетку заражает вирус, его ДНК не метилирована, и рестриктаза разрушает чужеродный генетический материал. Но бывает, что система дает сбой, и ДНК бактериофага метилируется. Значит, его потомство сможет заразить другие клетки. Мы встраиваем в клетки E.Coli меченные ферменты. И на их примере при помощи флуоресцентной микроскопии выясняем, случаен ли этот процесс, или есть клетки-предатели, в которых, например, метилазы больше, чем рестриктазы.»
• Транскрипция ДНК. Информация, записанная в ДНК, превращается в белки через несколько биохимических процессов. Один из них – синтез РНК на ДНК-матрице, которым заведует фермент РНК-полимераза. Их взаимодействие на «Лазерном пинцете» изучает Анатолий Арсениев: «Я пытаюсь отследить динамику движения полимеразы по молекуле ДНК. Конструирую небольшую молекулу по схеме: промотер (химический «старт»), ген, терминатор («стоп»). Заранее известна «дистанция». ДНК крепится «хвостом» к большой полимерной частице, а полимераза «сажается» на шарик поменьше. Когда начинается синтез, по тому, как меняется расстояние между шариками, можно судить о скорости движения полимеразы. Статистика экспериментов позволит понять, зависит ли эта скорость от последовательности «букв»-нуклеотидов, по которым проходит полимераза, или от действия внешних факторов.»

 

ПЕРВЫЙ РЕАЛИЗОВАННЫЙ МЕТОД флуоресцентной микроскопии сверхразрешения придумал как раз Штефан Хелль в 1994 году. Он получил название STED – Stimulated Emission Depletion, уменьшения (подавления) вынужденного излучения. В нем один лазерный луч возбуждает флуоресценцию в молекулах, а другой, проходящий вокруг него, подавляет. То есть когда одна точка светится, ее соседи молчат, не мешая определять ее положение собственной дифракционной картиной. Так «двуслойный» луч скользит по всему объекту, постепенно рисуя его изображение.

 

— Лазеры используются для возбуждения флуоресценции разных цветов. Флуорофоры бывают различными по химической природе, по особенностям взаимодействия с макромолекулами. Например, я использую краситель, который становится флуоресцентным, только встраиваясь в ДНК. Если он принимает квант света «на свободе», эту энергию он реализует в каком-то движении. А если он встроен в ДНК, ему не двинуться, и он начинает светиться, отдавая энергию. — На реализацию метода флуоресцентной микроскопии на нашей установке ушло несколько лет , — продолжает Антон. И сейчас мы это направление активно развиваем. Уже решаем задачи совместно с биологами. Например, пытаясь разобраться, как устроена микоплазма, самая маленькая бактерия.

 

Установка «Лазерный пинцет» и работа, кипящая вокруг нее, — многообещающий роман между физикой и биологией. Но пока «влюбленные» переживают конфетно-букетный период:

— Людям, которые работают в нашей лаборатории, в первую очередь интересна сама технология, — говорит Антон Сабанцев. – Мы выходим на контакт с биологами, уже отработав какие-то методы, пытаясь выяснить точки их применения. Ведь работа с пинцетом требует специфических знаний, тут скорее нужно быть физиком. Хотя некоторые биологи приходят сами, узнав о возможностях установки. Но почти всегда люди впервые слышат, что можно делать флуоресцентную микроскопию с разрешением в 30 нм, именно от нас. Следовательно, мало и понимания, что такое «Лазерный пинцет», чего с ним можно добиться.

А добиться, как вы уже поняли, можно многого. Особенно, если совершенствование установки будет продолжено. На этот счет у сотрудников «НаноБио» есть множество планов:

— В первую очередь, нам бы хотелось стабилизировать положение лазеров с помощью активной обратной связи, чтобы ловушка стала «жестче». Это могло бы существенно повысить точность наших измерений. Кроме того, добавить к пинцету инкубатор, который будет поддерживать нужные для живых клеток условия – тогда мы сможем проводить полноценные по времени эксперименты, в том числе с эукариотическими клетками сложных организмов.

 

Полное содержание на https://21mm.ru/news/nauka/poymat-dnk-za-khvost/