Лазерный мир

Оптические методы являются одними из основных способов исследования биологических объектов. Корреспондент портала InScience.news пообщался с сотрудниками лаборатории физико-химии биомембран биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова, которые исследуют физические механизмы на уровне молекул с помощью светящихся конструкций. Среди проектов коллектива — исследование систем направленной доставки антиоксидантов, синтез наночастиц для фотодинамической терапии рака, а также разработка метаболических сенсоров для органоидов клетки.

Модель фотоактивного и водорастворимого каротиноидного белка цианобактерий, выполняющего фотозащитную функцию. Красным цветом показан каротиноид. Источник: Тимофей Гостев и Евгений Максимов

Евгений Максимов, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией: Здание, где мы находимся, называется лабораторией искусственного климата. Изначально его использовали для исследований того, с чем могут столкнуться люди в космосе. В 70-х годах прошлого века акцент сместился в сторону Земли — на изучение «зеленых» объектов. Сейчас здесь расположена кафедра биофизики биологического факультета МГУ. Наша группа активно работает с различными белками: от синтеза до изучения их функций. У нас это хорошо получается, конечно, за счет взаимодействия с коллегами, как российскими, так и зарубежными. Благодаря этому мы стали выигрывать гранты и модернизировать приборную базу.

— Какое у вас есть оборудование?

Е. М.: Сейчас у нас более-менее хороший набор оптических методов — можно даже сказать, уникальный. Недавно появился мультифотонный микроскоп, который мы сами собрали и сейчас продолжаем модернизировать. Возбуждение молекул в нем происходит за счет поглощения нескольких квантов света, что позволяет воздействовать на довольно глубокие слои образца. Мы детектируем отдельные фотоны и то, как они распределены во времени и пространстве. В итоге мы получаем своего рода «кино», как живой объект реагирует на вспышку света. Эту вспышку мы можем сделать очень короткой, порядка миллиардной доли секунды, благодаря фемтосекундному лазеру. Светящиеся молекулы возбуждаются и затем релаксируют, то есть возвращаются в исходное энергетическое состояние, испуская свет. Разные красители и в разном окружении ведут себя иначе: в одном месте затухание будет происходить быстрее — различается время жизни возбуждения. Это может быть полезно, когда два соединения светятся в одном диапазоне, так как это помогает различить их сигналы.

Самое интересное, что можно делать на нашем микроскопе — исследовать взаимодействие окрашенных молекул, способных делиться энергией, когда они находятся близко друг от друга. Донор передает возбуждение акцептору, и тот испускает свет, а флуоресценция донора тушится. Так можно пометить две молекулы или их фрагменты и наблюдать, как они взаимодействуют друг с другом.

— По каким направлениям идет сейчас работа?

Е. М.: У нас несколько областей научной деятельности, но все они так или иначе связаны с исследованием процессов и объектов, которые порой не видны даже в микроскоп. Речь идет о конформационных изменениях, то есть перемещении фрагментов молекулы, внутриклеточных реакциях, переносах энергии и многом другом. Необходимо разрабатывать подходы, основанные на неких функциональных характеристиках, и в этом нам во многом помогает наше оборудование и активное взаимодействие с коллегами из других организаций. Например, одно из направлений — исследование встраивания каротиноидов в клеточные мембраны и оценка того, как это влияет на свойства последних.

Алексей Семенов, кандидат биологических наук, инженер: Каротиноиды защищают клетки от повреждения со стороны свободных радикалов при окислительном стрессе. При многих патологических процессах (например, авитаминозах, лучевом поражении, вследствие негативных экологических факторов, в процессе старения и при других состояниях) эффективность антиоксидантного действия в организме человека может снизиться, и потому бывает необходима медикаментозная доставка антиоксидантов.

Однако существует проблема: такие вещества плохо усваиваются в организме. В свободной форме каротиноиды либо идут в печень и там накапливаются, что может вызвать серьезные проблемы со здоровьем, либо разрушаются, и их эффективность значительно уменьшается. Потому мы ищем способы, как, с одной стороны, повысить биодоступность каротиноидов, и с другой — сохранить антиоксидантное действие.

Как это часто бывает, природа все уже давно придумала за нас. Цианобактерии, например, синтезируют особые белковые конструкции, которые способны эффективно осуществлять перенос каротиноидов. Белковая оболочка позволяет растворять каротиноиды в водной среде и тем самым повышает их усвояемость. Это приводит к высокой эффективности антиоксидантного воздействия, что обеспечивает надежную защиту от фотоповреждения при осуществлении бактерией фотосинтеза. Сегодня наша задача как ученых заключается в адаптации таких белков-переносчиков для направленной доставки каротиноидов в клетки организма человека.

— Применяете ли вы лазерно-оптические методы?

А. С.: Да, и в качестве модельных мембранных объектов мы используем взвесь липосом — сфер, составленных из одного или нескольких липидных слоев, сходных по строению с мембраной клетки. Цель наших экспериментов заключается в оценке изменений свойств мембран при доставке каротиноидов. Для этого липосомы помечены светящимся красителем, характеристики флуоресценции которого сильно зависят от окружения. Так, по кинетике затухания его флуоресценции мы можем получить информацию о свойствах липосом — например, оценить вязкость мембраны, что является характеристикой встраивания каротиноидов в нее. Мы полагаем, что в будущем такие знания позволят разработать систему оценки эффективности адресной доставки антиоксидантов и существенно расширить возможности подхода в целом.

— Как этот подход используется в медицине?

Е. М.: Применение биодоступных антиоксидантов очень перспективно при фотодинамической терапии рака. При этом в опухоль доставляется фотосенсибилизатор, который под действием света запускает каскад радикальных реакций, и за счет них происходит гибель окружающих клеток. Но нам важно защитить здоровые ткани — в этом помогут системы доставки антиоксидантов.

Даниил Гвоздев, кандидат биологических наук, научный сотрудник: Мы разрабатываем в том числе и комплексные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии. Все началось с любопытного направления, которое касалось использования реакционных центров фотосинтетического аппарата некоторых организмов в качестве компонента солнечных батарей. Напомню, что в реакционном центре при поглощении кванта света происходит разделение зарядов, с которого, по сути, и начинается электрический ток. Но дело в том, что без помощи природного светособирающего комплекса работа такого генератора крайне неэффективна — можно светить очень ярким светом, а ток на выходе окажется мал. Искусственный аналог светособирающего комплекса был найден быстро — полупроводниковые квантовые точки. Они отлично поглощают свет в широком диапазоне длин волн и очень ярко флуоресцируют, а значит, способны передавать энергию в реакционный центр.

Сам принцип оказался применим и в фотодинамической терапии. Поглощательная способность современных фотосенсибилизаторов все еще далека от идеальной, и дополнительные источники энергии могут быть полезны. Собственно, я в своей научной деятельности пытаюсь оценить перспективы использования люминесцентных частиц для этих целей. Сами по себе фотосенсибилизаторы имеют узкую полосу поглощения в красной области спектра. Можно собирать дополнительную энергию в видимой области длин волн — это сработает в случае поверхностных опухолей. Можно собирать свет в ближней инфракрасной области, используя эффект апконверсии. Это будет полезно для работы с опухолями глубокого залегания, так как инфракрасный свет лучше проникает в биологические ткани.

Спектр доступных люминесцентных наночастиц (впрочем, как и фотосенсибилизаторов) очень широк. Их гибридные комплексы являются очень сложной системой с внушительным количеством степеней свободы. За прошедшие восемь лет мы проделали большую работу по углублению и систематизации имеющихся данных в этой области. При определенных условиях и комбинациях компонентов удалось многократно усилить способность фотосенсибилизатора генерировать активные формы кислорода. Думаю, лучшие комбинации еще ждут своего открытия.

— А какими комбинациями вы пользуетесь сейчас?

Д. Г.: На первом этапе мы использовали полупроводниковые нанокристаллы с ядром из селенида кадмия, однако совершенно очевидно, что наночастицы этого типа не будут актуальны в медицине: тяжелые металлы обладают неспецифической цитотоксичностью, то есть губят все клетки подряд. Сейчас мы работаем с ними исключительно как с модельным объектом. В прошлом году перешли на синтез углеродных люминесцентных наночастиц. Объект малоизученный, достаточно капризный, но мы уже достигли определенного прогресса в этом направлении.

После того, как мы получили конструкцию, она должна попасть в нужную клетку и убить ее. Недавно мы осуществили доставку на основе белка трансферрина: в нашем организме он переносит ион железа из плазмы крови в клетку. Подобные исследования требуют тонкой технологии модификации поверхности наночастиц. Также нужен набор методов, позволяющих визуализировать гибридные комплексы внутри клетки, изучить особенности их внедрения и связанные с этим вещи. Все необходимое у нас в лаборатории имеется.

Е. М.: У нас также есть класс задач по исследованию фотоактивных белков и фотоактивных конструкций, которые могут быть использованы для оптогенетики. Оптогенетика в общем понимании связывается с регуляцией активности нервных клеток, а именно с проводимостью ионных токов с помощью канальных белков, которые запускаются светом. Вместе с тем достаточно вопросов обусловлено не только электрической проводимостью, но и возможностью уметь включать и выключать определенные процессы в клетке с помощью света. Для этих задач нужна оптогенетика другого уровня, для которого необходимы водорастворимые фотоактивные белки — такие конструкции мы как раз исследуем. Суть в том, что под действием света структура этих белков сильно меняется — мы пытаемся изучить и сами изменения, и скорость, с которой они происходят.

Елена Протасова, студент, инженер: Работа с водорастворимыми белками особенно внутри клетки имеет свои трудности. Внутриклеточные процессы могут сильно влиять на их состояние, поэтому необходимо уметь определять условия в цитоплазме и в разных компартментах. Я занимаюсь метаболическим биоимиджингом, то есть визуализацией состояния клетки или какого-то конкретного органоида по флуоресценции белков. Например, соединив белок-переносчик каротиноида с светящимся протеином, можно оценить, насколько эффективно клетка использует антиоксидант для защиты от активных форм кислорода — нормальных продуктов жизнедеятельности, но при нарушениях способных быть опасными. Кроме того, сейчас у нас есть совместный проект с лабораторией генетически кодируемых молекулярных инструментов Института биоорганической химии — это один из ведущих коллективов в мире, занимающийся изучением флуоресцентных белков. Вместе с ними мы сейчас испытываем внутриклеточные сенсоры, позволяющие определять кислотность. Также в нашей лаборатории была разработана методика измерения температуры на основе оптических свойств флуоресцентных белков. Выяснилось, что температура в разных органоидах варьируется: например, митохондрии «горячее» на пару градусов, чем остальные части клетки. Температура здесь рассматривается не в привычном для нас ключе, она скорее отражает метаболическую активность. Используя всего один флуоресцентный белок и присоединив к нему последовательности аминокислот, по которым он будет отправлен в ту или иную органеллу, можно по разнице во времени затухания флуоресценции определить ее функциональное состояние. Интересно, что сенсор реагирует только на температуру — в физиологических пределах на него не влияют ни кислотность, ни ионный состав.

— Каковы ваши планы? Собираетесь ли ближайшее время пробовать свои молекулярные разработки на клетках или животных?

Е. М.: У нас большие планы на эксперименты по доставке каротиноидов в клетки человека, однако проведение экспериментов на животных клетках — задача не простая. В своей работе мы в основном делаем упор на изучение процессов на молекулярном уровне: для нас важно именно понимание фундаментальных основ. Мы комбинируем различные подходы, чтобы результаты получались более полные и наглядные. Сейчас с нашим оборудованием мы имеем возможность исследовать явления не только в статике, но и в динамике, причем в обозримом будущем хотим собрать устройства с еще большим временным разрешением. Это поможет нам подробнее изучить процесс фотоактивации фотозащитных белков цианобактерий и начать использовать их в оптогенетике для практического применения. Работа с такими белками — очень сложная задача с высокими требованиями к объекту, методу получения и обработки данных, и нам не обойтись без установок класса «Megascience». Сейчас мы пишем заявки на проведение эксперимента на европейском рентгеновском лазере на свободных электронах (European XFEL), который предоставляет возможность определить структуру белка в динамике со сверхвысоким временным разрешением. Надеемся, что сможем с помощью этой уникальной установки изучить наши белки.

Источник: https://inscience.news/ru/article/russian-science/7243