Лазерный мир

Лазерный сканирующий микроскоп — это система, проводящая трёхмерное сканирование и отсекающая фоновую засветку, для получения увеличенных изображений с высокими показателями пространственного разрешения и контрастности.

Применение лазерных микроскопов

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (LSCM) предлагает несколько преимуществ по сравнению с обычной световой оптической микроскопией: возможность контролировать глубину резкости, устранять или уменьшать фоновую информацию вдали от фокальной плоскости и собирать последовательные срезы с объёмных образцов in vivo. Однако это точечное отверстие отображает только небольшую площадь предмета (около 100 нм) и, следовательно, должно быть отсканировано по всему предмету исследования, что требует времени и может привести к повреждению фотографии.

Лазерный микроскоп используют везде, где необходимо визуализировать, сохранять, в высоком разрешении, различные компоненты живых или фиксированных клеток и тканей, специально меченных флюорохромами. Для толстых объектов: сфероиды, органоиды, ткани и мелких животных, используют флуоресцентную микроскопию плоскостного освещения LSFM.

При внесении изменений в конструкцию, адаптации для материаловедения, конфокальный микроскоп является стандартным прибором для исследований в полупроводниковой промышленности, металлографии и других отраслях материаловедения. Дает максимально точную информацию о рельефе поверхности, строит профиль с разрешением до 5 нм, поэтому второе название этих систем – оптические профилометры.

Устройство лазерного микроскопа

Принцип работы лазерного микроскопа состоит в создании трехмерного образа за счет так называемых «оптических сечений» с использованием специальный флуоресцентных объективов с линзами из низкодисперсионного стекла. Прежде чем быть зафиксированной детектором или высокочувствительным фотоприёмником, флуоресценция улавливается объективом, ретранслируется обратно через сканирующие зеркала и через главное дихроичное зеркало. Оно отражает более короткие длины волн, такие как луч лазерного возбуждения, и пропускает более длинные волны, образованные Стоксовым сдвигом.

Длинноволновый сигнал затем передается на пару линз по обе стороны от pinhole точно сопряженного с фокальной плоскостью линзы объектива. Фотоны, собранные из объема объекта, коллимируются линзой объектива и фокусируются конфокальными линзами, создавая оптический разрез, в котором виден только свет из фокуса микроскопа. Поэтому флуоресценция, генерируемая выше или ниже, не будет правильно сколлимирована. Таким образом, pinhole эффективно действует как виртуальная апертура, ограничивая детектируемое излучение только одним ограниченным пространственным местоположением. Но это применимо для визуализации тонких образцов, а толстые становятся размытыми, засвеченными.

Их система сконструирована таким образом, чтобы из всего образца был виден только ультратонкий слой на заданной глубине, без лишней информации, расположенной вне области схождения, а объём картинке придаёт наложение снимков всех слоёв объекта. При необходимости, во время сканирования, могут использоваться дополнительные методы контрастирования для выделения изучаемых структур или отсечения ненужных данных.

В работе с конфокальными микроскопами используются специальные программы, с помощью которых создаются объемные изображения из серии снимков микропрепарата и рассматривать их под разными углами, они анализируют внутриклеточные структуры и отвечают за автоматизацию всех рабочих систем. Благодаря послойному просмотру препарата появилась возможность оценивать такой процесс, как морфокинетика клеточного деления, исследовать фрагменты цитоскелета, изучать адгезии и межклеточные взаимодействия, измерять проницаемость цитоплазматических и митохондриальных мембран и т.д. Для работы конфокальных систем не требуется вакуум, благодаря чему, образ делается в реальном времени, осуществляя наблюдение в цвете.

Дополнительно используются различные методы: поляризация, фазовый и интерференционный контрасты. Пригоден для количественных исследований свойств материалов и веществ. Характеризуется максимально высоким разрешением для оптических микроскопов и максимальной глубиной резкости 3D моделей.

Особенности применения лазерной микроскопии

В современных серийных комплексах конфокальной микроскопии полностью автоматизированы процессы: подачи, перемещения, смены длины волны и интенсивности возбуждения, смены увеличения, контроля температуры объекта, газового состава внутри инкубатора, сканирования, обработки полученных данных и подготовки отчётности. Особенности этого класса оборудования не позволяют применять все доступные возможности в прикладных задачах in vivo, в виду особой подвижности живых организмов. Послойное сканирование с последующей компиляцией 3D изображения на основе данных снимков невозможно на быстродвижущихся объёмных объектах из-за разного положения цели на сделанных снимках.

Темп сканирования до сих пор является одним из самых больших недостатков конфокальной микроскопии. Как указано выше, излучение лазера, концентрируется в очень маленьком месте. Это пятно перемещается с очень высокой скоростью по одной оси и выглядит невооруженным глазом в виде линии. Затем эта «линия» перемещается по другой оси для медленного сканирования образца. Для манипулирования положением светового пятна используется несколько подходов и технологий; к ним относятся: гальванические зеркала, гальванические резонансные зеркала, шестиугольные призмы или вращающиеся диски.

Проблема быстроты сканирования подвигла учёных к созданию метода флуоресцентной микроскопии плоскостного освещения, также называемая одноплоскостной микроскопией освещения или SPIM. LSFM является щадящим способом визуализации чувствительных проб или быстрых биологических процессов in vivo. Предмет освещается только в одной области за один раз и обнаруживается с перпендикулярного направления. Поскольку не наблюдается расфокусированного возбуждения, фототоксические эффекты сводятся к фокальной плоскости. Изображение светового листа имеет внутреннее оптическое сечение.

Полное содержание статьи на https://www.microsystemy.ru/info/articles/lazernyy-skaniruyushchiy-mikroskop/