Лазерный мир

На протяжении десятилетий визуализацию клеток и тканей для цифровой патологии, исследований рака и головного мозга обеспечивала оптическая микроскопия. Образцы обычно изучаются в замороженных срезах. В большинстве из этих систем для зондирования образца используются конфокальная микроскопия и однофотонное возбуждение, обычно от источника света с непрерывной волной. Многофотонная микроскопия применяется при визуализации ткани в её естественной среде, когда требуются глубокое проникновение в ткань и разрешение клеточного уровня. В лазерных сканирующих многофотонных микроскопах свет от сверхбыстрого лазера жёстко фокусируется и сканируется по образцу с помощью быстрых зеркал. Изображение создаётся путём определения интенсивности сигнала флуоресценции в каждой точке и пространственного отображения с помощью компьютерного программного обеспечения.

Источник возбуждения и реализация обнаружения сигнала имеют решающее значение для биологической визуализации, простоты использования и времени безотказной работы прибора. Многофотонная микроскопия использует высокофокусированный лазерный луч в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR), обычно между 780 и 1300 нм, для получения нелинейных оптических эффектов, основанных на взаимодействии нескольких фотонов, одновременно поступающих на молекулу. Следовательно, с ростом количества облучивших молекулу фотонов интенсивность генерируемого сигнала увеличивается не линейно, а возводится в квадрат (для двухфотонных эффектов) или в третью степень (для трёхфотонных). Это явление ограничено очень плотным объёмом, сосредоточенным в плоскости фокуса, что значительно уменьшает сечение поглощения от окружающего материала. Более того, использование длин волн в диапазоне NIR приводит к меньшему рассеянию в ткани и обеспечивает более высокую глубину проникновения по сравнению с обычными линейными конфокальными методами. Это позволяет проводить 3D-срезы с меньшими фотообесцвечиванием и фототоксичностью, которые мешают однофотонным методам.

Возможны измерения в реальном времени и с длительной экспозицией — например, в экспериментах по изучению живых животных и взаимодействия таргетных лекарственных средств с мишенями. Один из ярких примеров использования лазерной сканирующей многофотонной микроскопии — визуализация в глубине живого головного мозга животных (Рисунок 1d) с использованием стандартных маркеров, таких как GCaMP.

Большая глубина проникновения в сочетании с меньшим фотоповреждением — основные преимущества использования лазерной сканирующей многофотонной микроскопии для живых или фиксированных нативных объёмных образцов, таких как головной мозг, эмбрионы, живые органы или животные, или для выращенных in vitro сфероидов или органоидов.

Поиск универсальных решений

По мере роста числа практических приложений многофотонной микроскопии растёт и спрос на простой в использовании, переносимый и мультимодальный инструмент, который можно адаптировать к любому рабочему пространству в помещении. Идеальная система должна выдавать высококачественные результаты и быстро обрабатывать большие объёмы данных, обеспечивая при этом мощный рабочий процесс, экономящий время. Кроме того, возможность выполнять мультимодальный анализ в одной и той же области интереса без неудобств, связанных с перемещением образца в другую систему, максимизирует содержание и обеспечивает более мощную дополнительную информацию.

Прочные и готовые к использованию в промышленности устройства, которые могут использоваться для клинических исследований и способны работать в любых помещениях, вероятно, представляют собой будущее лазерной сканирующей многофотонной микроскопии. Коммерчески доступным системам не хватает гибкости и мобильности для использования за пределами лаборатории. Сканирующая головка (включая оптику с направленным лучом) и наличие сверхбыстрого лазерного источника имеют решающее значение для общей функциональности и удобства использования микроскопа. В большинстве систем эти два компонента разделены, и обычно они производятся разными поставщиками.

Промышленным стандартом для фемтосекундной лазерной системы уже почти 40 лет служит титан-сапфировая лазерная технология (Ti:sapphire). Эти системы хрупкие, требуют большого оптического стола, подачи воды для охлаждения и специальной инфраструктуры. Они очень сложны, весьма небезопасны, и для их эксплуатации, как правило, нужны квалифицированные специалисты. Их размер и вес, а также количество потребляемой ими энергии делают их непригодными для большинства клиник, и, кроме того, их невозможно транспортировать. Клиническим исследователям нужен портативный мультимодальный микроскоп «под ключ», который можно установить в любом помещении и которым сможет пользоваться большинство сотрудников.

Приборы нового поколения

Конструкция сверхгибкого лазерного сканирующего многофотонного микроскопа для получения изображений in vivo основана на очень гибком интерфейсе и лазерном дизайне. Способность легко маневрировать сканирующей головкой — секрет адаптации к работе с широким спектром объектов, от слайдов до живых мышей. Конструкция сканирующей головки имеет решающее значение для того, чтобы микроскоп можно было использовать в практически любом эксперименте. Микроскоп должен иметь гальвано-резонансные сканеры, фотоумножительные трубки, объективы, широкоугольную камеру и подсветку, полную оптику для сканирования и лазеры — всё в одном компактном, готовом к работе модульном форм-факторе (Рисунок 1) [1].

Мощность и размер лазерного источника имеют решающее значение при создании действительно портативного и гибкого лазерного сканирующего многофотонного микроскопа. Волоконные лазеры хорошо подходят для этой цели, поскольку они компактны, прочны и энергоэффективны практически для любого внутреннего рабочего пространства. Они имеют воздушное охлаждение и не требуют технического обслуживания, поэтому нет необходимости в подаче охлаждённой воды или сервисном обслуживании. Например, микроскоп серии MPX, недавно разработанный Prospective Instruments, оснащён двухволновым фемтосекундным волоконным лазером с длиной волны 1040 нм с фиксированной выходной мощностью (>500 мВт) и вторым широко настраиваемым лазером в диапазоне от 750 до 960 нм и от 1150 до 1300 нм (>200 мВт). Длительность импульса составляет <140 фс при работе с частотой повторения 80 МГц. Все эти параметры замерены во взаимодействии с образцами и достаточны для сечения >1 мм.

Многофотонная визуализация с высоким разрешением была продемонстрирована на животных, включая рыбку данио и плодовую мушку (дрозофилу). В обоих случаях получена бесценная информация для понимания и упреждения патофизиологии человека. В недавних экспериментах как сигналы возбуждения (130 фс при 1040 нм), так и сигналы обнаружения отображались через 20-кратный водно-иммерсионный объектив (NA 1.0).

 Многофотонное трёхмерное z-стековое изображение живой личинки данио, экспрессирующей альфа-катенин-YFP (жёлтый флуоресцентный белок) (зелёный) и tp1:mCherry-NLS (сигналы ядерной локализации) (красный). Проекция максимальной интенсивности z-стека толщиной 510 мкм с шагом 10 мкм — генерация второй гармоники (SHG) (синий) и двухфотонные каналы (зелёный и красный) (а). Z-слои, проходящие от 20 мкм (b) до 300 мкм (i) с шагом 40 мкм. Крупные планы, изображающие специфические особенности, такие как глаз (b—d) или работающее сердце личинки данио (g, h). Масштабная линейка: 100 мкм. Источник: Prospective Instruments.

Масштабы использования лазерной сканирующей многофотонной микроскопии в клинических и биологических исследованиях быстро растут благодаря её преимуществам по сравнению с традиционной оптической визуализацией. Этот инструмент помог углубить понимание различных заболеваний, функциональности нейронов и структурных взаимосвязей, а также процессов развития. До сих пор ограничения, накладываемые на традиционный инструментарий, замедляли прогресс в основных исследованиях и промышленном применении. Однако следующее поколение систем многофотонной микроскопии будет способно произвести революцию в биомедицинских исследованиях и преодолеть традиционные барьеры, ограничивающие доступ к визуализации глубоких тканей. Будущие разработки и усовершенствования данной платформы включают дополнительные методы, такие как трёхфотонная и флуоресцентная живая визуализация, улучшенные оптические характеристики с использованием адаптивных методов, а также более быстрый и интеллектуальный рабочий процесс визуализации. И эти системы вполне могли бы осуществить все эти улучшения, сохраняя прежние физическую форму, эффективность и гибкость.

Полное содержание на https://22century.ru/popular-science-publications/multiphoton-microscope